Dasar Teori
Isolasi merupakan suatu proses memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Dalam kegiatan mikrobiologi pembuatan isolat dilakukan dengan cara mengambil sampel mikrobiologi dari lingkungan yang ingin diteliti. Dari sampel tersebut kemudian dibiakkan dengan menggunakan media universal atau media selektif, tergantung tujuan yang ingin dicapai. Jika menggunakan media universal akan diperoleh biakan mikroba campuran. Untuk proses identifikasi maupun isolasi jenis tertentu saja, dilakukan proses pembuatan isolat tunggal dari isolat campuran tersebut.
Isolat tunggal atau biakan murni merupakan biakan yang asalnya dari pembelahan satu sel tunggal. Dalam isolasi, ada beberapa metode yang digunakan untuk memperoleh biakan murni dari isolat, yaitu dengan metode cawan gores (streak plate), cawan tuang (pour plate), sebar (spread plate), dan mikromanipulator. Dua di antaranya yang sering digunakan adalah teknik cawan gores dan teknik cawan tuang. Dua metode tersebut akan dijelaskan lebih lanjut.
Isolasi merupakan suatu proses memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. Dalam kegiatan mikrobiologi pembuatan isolat dilakukan dengan cara mengambil sampel mikrobiologi dari lingkungan yang ingin diteliti. Dari sampel tersebut kemudian dibiakkan dengan menggunakan media universal atau media selektif, tergantung tujuan yang ingin dicapai. Jika menggunakan media universal akan diperoleh biakan mikroba campuran. Untuk proses identifikasi maupun isolasi jenis tertentu saja, dilakukan proses pembuatan isolat tunggal dari isolat campuran tersebut.
Isolat tunggal atau biakan murni merupakan biakan yang asalnya dari pembelahan satu sel tunggal. Dalam isolasi, ada beberapa metode yang digunakan untuk memperoleh biakan murni dari isolat, yaitu dengan metode cawan gores (streak plate), cawan tuang (pour plate), sebar (spread plate), dan mikromanipulator. Dua di antaranya yang sering digunakan adalah teknik cawan gores dan teknik cawan tuang. Dua metode tersebut akan dijelaskan lebih lanjut.
Metode Isolasi
1. Metode Cawan Gores
Metode cawan gores mempunyai dua keuntungan, yaitu menghemat bahan dan waktu, metode cawan gores jika dilaksanakan dengan baik, kebanyakan akan menyebabkan teriisolasinya mikroorganisme yang diinginkan. Beberapa jenis teknik metode cawan gores yang dilakukan seperti goresan T, goresan radian, goresan kuadran, goresan persegi, dan goresan langsung (zig zag).
Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi. Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan.
2. Metode Cawan Tuang
Metode cawan tuang yaitu untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme adalah dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan. Metode cawan tuang i memboroskan bahan dan waktu namun tidak memerlukan keterampilan yang tinggi. Beberapa jenis metode cawan tuang, yaitu seperti agar miring dan agar tegak.
Agar miring dapat memperluas daerah pertumbuhan mikroba, biasanya agar miring digunakan sebagai tempat penyimpanan mikroba yang akan diisolasi. Agar miring adalah agar pada tabung reaksi yang diletakkan miring pada waktu pendinginan. Agar miring ini merupakan salah satu cara yang mudah untuk kulturisasi mikroba terutama yang bersifat aerobik atau anaerobik fakultatif.
Sedangkan agar tegak memiliki luas permukaan untuk pertumbuhan mikroba tidak luas dan diisolasikan kedalam media agar. Pada agar tegak, mikroba ditusukan ke dalam agar menggunakan ose jarum. Agar tegak diigunakan untuk menguji gerak bakteri secara mikroskopis. Agar tegak adalah media agar dalam tabung reaksi yang diletakkan tegak pada waktu pendinginan, digunakan untuk menstimulir pertumbuhan mikroba dalam keadaan kekurangan oksigen atau anaerob.
Isolasi Dengan Cara Pengenceran (Dilution)
1. Teknik Preparasi Suspensi
Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel :
a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu, batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water.
b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass.
c. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antar alain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Unutk sampel dari tanh tak perlu dimaserasi
2. Teknik Pengenceran Bertingkat
Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.
Cara Kerja :
a. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar dapat dilihat pada gambar disamping)
b. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama.
Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi. Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan.
2. Metode Cawan Tuang
Metode cawan tuang yaitu untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme adalah dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan. Metode cawan tuang i memboroskan bahan dan waktu namun tidak memerlukan keterampilan yang tinggi. Beberapa jenis metode cawan tuang, yaitu seperti agar miring dan agar tegak.
Agar miring dapat memperluas daerah pertumbuhan mikroba, biasanya agar miring digunakan sebagai tempat penyimpanan mikroba yang akan diisolasi. Agar miring adalah agar pada tabung reaksi yang diletakkan miring pada waktu pendinginan. Agar miring ini merupakan salah satu cara yang mudah untuk kulturisasi mikroba terutama yang bersifat aerobik atau anaerobik fakultatif.
Sedangkan agar tegak memiliki luas permukaan untuk pertumbuhan mikroba tidak luas dan diisolasikan kedalam media agar. Pada agar tegak, mikroba ditusukan ke dalam agar menggunakan ose jarum. Agar tegak diigunakan untuk menguji gerak bakteri secara mikroskopis. Agar tegak adalah media agar dalam tabung reaksi yang diletakkan tegak pada waktu pendinginan, digunakan untuk menstimulir pertumbuhan mikroba dalam keadaan kekurangan oksigen atau anaerob.
1. Teknik Preparasi Suspensi
Sampel yang telah diambil kemudian disuspensikan dalam akuades steril. Tujuan dari teknik ini pada prinsipnya adalah melarutkan atau melepaskan mikroba dari substratnya ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Macam-macam preparsi bergantung kepada bentuk sampel :
a. Swab (ulas), dilakukan menggunakan cotton bud steril pada sampel yang memiliki permukaan luas dan pada umumnya sulit dipindahkan atau sesuatu pada benda tersebut. Contohnya adalah meja, batu, batang kayu dll. Caranya dengan mengusapkan cotton bud memutar sehingga seluruh permukaan kapas dari cotton bud kontak dengan permukaan sampel. Swab akan lebih baik jika cotton bud dicelupkan terlebih dahulu ke dalam larutan atraktan semisal pepton water.
b. Rinse (bilas) ditujukan untuk melarutkan sel-sel mikroba yang menempel pada permukaan substrat yang luas tapi relatif berukuran kecil, misalnya daun bunga dll. Rinse merupakan prosedur kerja dengan mencelupkan sampel ke dalam akuades dengan perbandingan 1 : 9 (w/v). Contohnya sampel daun diambil dan ditimbang 5 g kemudian dibilas dengan akuades 45 ml yang terdapat dalam beaker glass.
c. Maseration (pengancuran), sampel yang berbentuk padat dapat ditumbuk dengan mortar dan pestle sehingga mikroba yang ada dipermukaan atau di dalam dapat terlepas kemudian dilarutkan ke dalam air. Contoh sampelnya antar alain bakso, biji, buah dll. Perbandingan antar berat sampel dengan pengenceran pertama adalah 1 : 9 (w/v). Unutk sampel dari tanh tak perlu dimaserasi
2. Teknik Pengenceran Bertingkat
Tujuan dari pengenceran bertingkat yaitu memperkecil atau mengurangi jumlah mikroba yang tersuspensi dalam cairan. Penentuan besarnya atau banyaknya tingkat pengenceran tergantung kepada perkiraan jumlah mikroba dalam sampel. Digunakan perbandingan 1 : 9 untuk sampel dan pengenceran pertama dan selanjutnya, sehingga pengenceran berikutnya mengandung 1/10 sel mikroorganisma dari pengenceran sebelumnya.
Cara Kerja :
a. Sampel yang mengandung bakteri dimasukan ke dalam tabung pengenceran pertama (1/10 atau 10-1) secara aseptis (dari preparasi suspensi). Perbandingan berat sampel dengan volume tabung pertama adalah 1 : 9 dan ingat akuades yang digunakan jika memakai teknik rinse dan swab sudah termasuk pengencer 10-1. Setelah sampel masuk lalu dilarutkan dengan mengocoknya (pengocokan yang benar dapat dilihat pada gambar disamping)
b. Diambil 1 ml dari tabung 10-1 dengan pipet ukur kemudian dipindahkan ke tabung 10-2 secara aseptis kemudian dikocok dengan membenturkan tabung ke telapak tangan sampai homogen. Pemindahan dilanjutkan hingga tabung pengenceran terakhir dengan cara yang sama, hal yang perlu diingat bahwa pipet ukur yang digunakan harus selalu diganti, artinya setiap tingkat pengenceran digunakan pipet ukur steril yang berbeda/baru. Prinsipnya bahwa pipet tidak perlu diganti jika memindahkan cairan dari sumber yang sama.
Comments
Post a Comment